细胞转染原理
细胞转染实验原理：外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法、脂质体介导法和病毒介导法。
利用HIV病毒将自身基因组插入整合到宿主基因组的特性。在293T细胞内先转染三个质粒，分别为HIV病毒合成所需要的组分（改造过的），其中一个带有装配入病毒衣壳信号序列的质粒上插入要稳转的序列。
原理：细胞冷冻与复苏是细胞培养的常规工作，可以解决细胞因为连续继代造成的退变或转化。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。
(1)将重组质粒导入原核细胞称转化，通常用氯化钙法使大肠杆菌细胞处于感受态，从而将外源DNA导入细胞。另一个常用方法是用脉冲高压电瞬间处理，使外源DNA高效导入细胞，称为电穿孔法。
怎样构建慢病毒载体用来标记原代细胞的细胞骨架?
1、将重组质粒用脂质体法（invitrogen公司的lipofectamine 2000试剂）导入细胞，或用磷酸钙法导入细胞即可。如果稳定表达，建议用lentivirus vector ，也就是慢病毒载体导入细胞即可。
2、动物病毒进入细胞的方式有两种：一是细胞以主动胞饮的方式使病毒进入，二是某些有囊膜的病毒，通过其囊膜与细胞质膜融合呃呃呃方式进入细胞，如HIV，或通过胞饮进入细胞，然后与胞饮囊泡的膜融合进入细胞质中。
3、靶向CHO细胞关键调节基因， 通过基因工程手段改造和驯化产生CHO细胞亚系，使表现出更好的凋亡抗性、 代谢、 糖基化、 蛋白表达、 细胞周期调节、 增殖、 分泌或细胞骨架动力学。
为什么原代培养的细胞难转染?适合原代细胞转染的方法有哪些?
脂质体转染适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前实验室最方便的转染方法之一，其转染率较高，优于磷酸钙法。
理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。
细胞系不同，它们所需的转染条件自然也不相同。举例来说，悬浮培养的鼠类原代细胞，就比贴壁培养的人类细胞更难转染。此外，神经元和巨噬细胞也令人颇为头疼，标准方法很难将siRNA转染进去。
当我们做转染实验的时候，总会遇到一些难转染的细胞。恰巧课题组研究的是原代细胞、神经细胞或者是免疫细胞，化学转染方法反复试验失败，这时候就得借助电转来帮助我们推进实验进程了。
目的：掌握将冻存良好的细胞复苏、培养的基本原理与方法。原理：细胞冷冻与复苏是细胞培养的常规工作，可以解决细胞因为连续继代造成的退变或转化。
一般认为，在第一代培养的原代细胞和转移到第十代的细胞统称为原代细胞培养。使原代细胞在人工条件下存活、生长、增殖和转移，研究细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题。
原代培养中细胞传多少代?
1、原代细胞是指从机体上分离得到的细胞，原代细胞可以传代，但传代数一般不超过10代，而原代的神经细胞是不能传代的(神经细胞是不能分裂的)。
2、传代培养是10—50代，50代之后有的会获得不死性细胞，10代是原代培养。
3、原代培养的细胞一般传至10代左右就不容易传下去了，细胞的生长就会出现停滞，大部分细胞衰老死亡。传代培养一般传到40－50代，这种传细胞叫细胞株。细胞株的遗传物质没有改变。其分裂能力与原代培养的一样。
4、一般来说，细胞在传至10~50代左右时，增殖会逐渐缓慢，以至于完全停止，这时部分细胞的细胞核型可能会发生变化。
5、我很确定的是，“就教材里说原代培养是1---10代 传代培养：10--50代是细胞株 50代以后就是细胞系”你这些理解是完全正确的！我们的老师就是这么教的。
6、因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。
原代的细胞到底能不能够构建稳定的细胞株呢?
1、构建方法：先把质粒整合到染色体上后，用相应的质粒DNA中的抗性标志来筛选该细胞系，就行成了稳定表达的细胞株。细胞株是用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。
2、细胞培养10代（原代培养）就成为细胞株，10~50代（传代培养），此时为细胞株。少数细胞遗传物质发生改变，获得不死性（类似癌细胞），成为细胞系。
3、因此原代培养细胞的部分生物学特征尚不够稳定，在进行较为严格的对比性实验研究时，还需先对细胞进行短期传代。近年来，原代培养技术已被广泛应用于中医药研究尤其是中药研究之中。
